2024年1月23日，杭高院生命与健康科学院/中国科学院分子细胞卓越创新中心孟飞龙课题组联合上海交通大学医学院上海市免疫学研究所叶菱秀课题组完成的题为“C-to-G editing generates double-strand breaks causing deletion, transversion, and translocation”的研究工作发表于国际期刊<Nature Cell Biology>。
该项研究工作揭示了胞嘧啶碱基编辑器存在导致基因组不稳定性增加的风险，通过深入分析副产物的发生机制，开发了副产物减少的更安全有效的碱基颠换工具，助力碱基颠换编辑器的开发和应用，为未来临床遗传疾病的基因治疗提供了新思路。
碱基编辑器是近年来新开发的不依赖DNA双链断裂即可实现特定位点碱基替换突变的基因编辑工具，可以高效地在基因组特定位点上引入点突变，因此碱基编辑器目前已被广泛应用于培育点突变动植物模型、构建疾病模型、治疗血液系统肿瘤等场景，在研究和治疗点突变遗传疾病方面具有极大的潜力。因此，评估现有碱基编辑器的安全性、开发更安全有效的碱基编辑器具有重要意义。此外，在前期研究中，叶菱秀课题组揭示了B细胞中胞苷脱氨酶AID引起的抗体基因不同类型片段缺失/插入突变的发生机制，建立了各种基因组低频事件的检测分析方法。而相似的，胞嘧啶碱基编辑器依赖胞苷脱氨酶发挥作用，也有可能产生各种低频副产物，关于它们的检测分析以及具体产生机制还有待研究。
目前开发的碱基编辑器主要包括实现C>T的CBE、实现A>G的ABE、在CBE基础上构建的实现C>G的CGBE、在ABE基础上开发的实现A>Y的AYBE等等。CGBE在CBE基础上引入UNG糖苷酶，增加胞嘧啶脱氨产物尿嘧啶（U）的切除效率，提高脱碱基位点（AP位点）的产生频率，从而提高C>G碱基颠换突变概率，但同时也增加了片段缺失突变等副产物的产生，这会给未来将其应用于临床疾病治疗带来较大风险。
为了评估现有CGBE的编辑效果，研究人员通过深度测序，检测了多种CGBE的编辑产物，发现与CBE相比，CGBE在碱基编辑过程中产生更多的片段缺失、插入副产物。通过分析其具体图谱显示，它们的发生位点与靶向编辑位点和Cas9-nickase的切割位点密切相关。通过DSB末端检测技术END-seq，研究者在CGBE编辑的细胞中检测到大量DSB末端中间体。这些DSB末端中间体会导致染色体易位的增加，说明现有CGBE存在造成基因组不稳定性增加的风险。通过筛选影响副产物生成的DNA损伤修复因子，研究人员揭示了CGBE在碱基编辑过程中产生缺失/插入突变的机制，UNG切除Cas9-nickase非靶向链上的U产生AP位点，胞内APE酶切割AP位点造成DNA链断裂，再加上Cas9-nickase蛋白切割其靶向链造成的DNA链断裂，导致DSB的增加，DSB经细胞内易错修复连接通路修复后（如NHEJ，非同源末端连接通路），产生了更多的片段缺失、插入等副产物。最后，研究人员利用蛋白质定向进化技术，引入优化的AP位点保护蛋白HMCES，抑制APE酶的切割作用，有效地从源头减少了DSB的产生，构建了更加安全有效的CGBE。
综上，该项研究全面深入评估了现有CGBE的碱基编辑效果，发现CGBE编辑会产生大量DSB，通过保护UNG产生的AP位点，开发了不影响C>G颠换突变效率、但副产物减少的更加安全的新型CGBE。
杭高院为第一完成单位。杭高院生命与健康科学院博士后黄敏、尚雅芳，中国科学院分子细胞卓越创新中心博士生秦艺宁为该论文的共同第一作者。杭高院生命与健康科学院/中国科学院分子细胞卓越创新中心孟飞龙研究员和上海交通大学医学院上海市免疫学研究所叶菱秀研究员为该论文共同通讯作者。项目经费支持来自中国科学院、国家自然基金委、科技部、上海市科委等。
