国科大杭高院环境学院汪海林教授工作室在DNA表观遗传修饰分析检测方面取得新进展，相关成果最近以“Hyperactive DNA cutting for Unbiased UHPLC-MS/MS quantification of epigenetic DNA marks by Engineering DNase I Mutants”为题，发表于Analytical Chemistry。

DNA表观遗传修饰，如5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)等，已被证明与多种疾病和癌症诊断与治疗的潜在生物标志物相关。目前对DNA表观遗传修饰的检测，以液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)作为DNA表观遗传修饰的表征和定量的金标准。其中，将DNA转化为2 ' -脱氧核苷是实现灵敏准确的LC-MS/MS定量的重要预处理步骤。DNase I作为实验室常用的核酸内切酶，可以与多种酶配合，将DNA酶解。但野生型DNase I存在诸多局限性，如在无机盐离子条件下活性明显下降、无法同时完全释放未修饰和修饰的脱氧核苷等，对DNA表观遗传修饰定量的精准性造成了影响。

该研究通过基因工程手段，构建了两种DNase I超高活性工程核酸酶N74K和Q9R:E13R:N74K，报道了一种无误差定量5mC水平的LC-MS/MS分析法。研究发现，DNase I工程蛋白在高盐和较宽泛的pH范围内均能表现出高度活跃的DNA切割活性；二价金属离子Mg²⁺和Mn²⁺可以帮助DNase I克服因高离子强度造成的活性抑制。同时，通过LC-MS/MS发现，得益于对DNA切割的高度活性，工程DNase I突变体辅助的DNA消化可以促进5mdC切割并消除5mC测量的偏差，准确地定量DNA 5mC修饰水平。

图一DNase I工程蛋白构建与纯化，及利用该蛋白辅助进行5mdC修饰水平的LC-MS/MS检测

该研究通过设计超高活性工程DNase I突变体，建立了一种高效准确定量5mC及其他酶解受限DNA修饰的LC-MS/MS分析法，为后续DNA表观遗传修饰及DNA加合物表征定量分析等研究提供了技术手段。

论文的第一作者是国科大杭州高等研究院环境学院2020级硕士研究生宋星睿，通讯作者为赖玮毅副研究员。研究得到国家自然科学基金、国家重点研发计划项目和安捷伦大学合作等项目的支持。